Language
Хонингование

Блог

ДомДом / Блог / Хонингование
search

May 14, 2023

2023 FAB 40: Гигант прецизионной обработки листового металла Cadrex Manufacturing Solutions: взгляд на консолидацию

Oct 08, 2023

2023 FAB 40: Гигант прецизионной обработки листового металла Cadrex Manufacturing Solutions: взгляд на консолидацию

May 12, 2023

Спустя 25 лет после премьеры «Секса в большом городе» эти модные тенденции сохраняются

Jul 08, 2023

Спустя 25 лет после премьеры «Секса в большом городе» эти модные тенденции сохраняются

May 24, 2023

32 Проблема

Отправьте запрос
ПРЕДСТАВЛЯТЬ НА РАССМОТРЕНИЕ

Nov 22, 2023

Хонингование

Том коммуникативной биологии

Биология связи, том 5, Номер статьи: 1157 (2022) Цитировать эту статью

3449 Доступов

1 Цитаты

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Открытие антител, основанных на иммунизации, затруднено из-за нехватки антигенспецифических В-клеток. Идентификация этих клеток сродни поиску иголки в стоге сена. Существующие и новые технологии, хотя и эффективны, ограничены с точки зрения охвата антигенспецифического репертуара. Мы сообщаем о массовой очистке антигенспецифичных B-клеток и преимуществах, которые она дает различным платформам по поиску антител. Используя пять различных антигенов, мы показываем уровень результативности 51–88% по сравнению с примерно 5% при использовании традиционных методов. Мы также показываем, что эта очистка очень эффективна с потерей всего около 2% антигенспецифических клеток. Кроме того, мы сравнили клоны, в которых родственные цепи сохранены, с клонами из дисплейных библиотек, в которых цепи либо из тотальных В-клеток (TBC), либо из антиген-специфических В-клеток (AgSC) подверглись комбинаторному спариванию. Мы обнаружили, что клоны с парами родственных цепей и комбинаторные клоны из библиотеки AgSC имели более высокую частоту функциональных клонов и демонстрировали большее разнообразие последовательностей и паратопов по сравнению с клонами из библиотеки TBC. Этот метод антигенспецифической селекции В-клеток является примером улучшения процесса с сокращением времени цикла и затрат за счет удаления нежелательных клонов перед скринингом и увеличения шансов включения в репертуар желательных и редких функциональных клонов.

Monoclonal antibodies as a promising therapeutic modality are now widely accepted. As of now there are 129 antibody therapeutics approved or under review in the US and EU1, (August 17, 2020)." href="/articles/s42003-022-04129-7#ref-CR2" id="ref-link-section-d65862886e640"> 2. Открытие группы Денниса Бертона о том, что антитела, полученные путем клонирования B-клеток, обладают большей терапевтической эффективностью по сравнению с антителами, полученными из комбинаторных библиотек от пациентов, выздоравливающих от ВИЧ3, привело к резкому увеличению усилий по обнаружению терапевтических антител у иммунизированных животных или выздоравливающих пациентов4,5. ,6,7,8,9,10,11,12. Однако обнаружение антител у иммунизированных животных или выздоравливающих пациентов представляет собой сложный процесс из-за нехватки антигенспецифических клеток в огромном разнообразии общего репертуара антител. Частота антигенспецифических клеток, даже после сильной иммунной реакции, составляет всего лишь 0,01–0,1% от общего числа В-клеток13,14,15. Это создает сложную задачу даже для самых передовых скрининговых платформ по изучению всего иммунного репертуара. Таким образом, платформы, которые полагаются на иммунизацию животных или использование В-клеток выздоравливающих пациентов, имеют дело с огромным количеством нерелевантных клеток, что приводит к значительному сокращению времени между скринингом и выявлением антигенспецифических совпадений. Популярным подходом к глубокому скринингу иммунного репертуара является создание иммунизированных фаговых библиотек, некоторые из которых, как сообщается, являются хорошим источником мощных антител16,17,18. Однако во время создания библиотек иммунного дисплея пары родственных цепей из небольшого процента антигенспецифичных клеток подвергаются обширному комбинаторному спариванию с обширным репертуаром цепей из неантигенспецифических клеток19. Несмотря на такие комбинаторные пары, родительские родственные пары, вероятно, сохраняются с низкой частотой18. Мы предположили, что увеличение частоты пар родительских родственных цепей путем конструирования и пэннинга иммунизированной библиотеки, созданной из антиген-специфических В-клеток (AgSC), возможно, может обеспечить больший успех в изучении антиген-специфического репертуара.

Антигенспецифические В-клетки обычно выделяют методом сортировки флуоресцентно-активируемых клеток (FACS)6,7,8,9,10,11,12,20,21. Хотя проточная цитометрия хорошо работает для клонирования одиночных B-клеток, ее использование для массового выделения ограничено ее скоростью и резким воздействием, которое электромагнитное поле может оказать на целостность клеток при высокой скорости сортировки22, что приводит к значительной потере количества и качества клеток23. Следовательно, необходимы мягкие, но эффективные методы выделения AgSC от иммунизированных животных для глубокого и широкого изучения иммунного репертуара. Мы разработали простой, но мощный метод массового отбора антигенспецифических B-клеток памяти (MBC) для быстрой и эффективной идентификации моноклональных IgG у иммунизированных мышей. Этот метод основан на том факте, что MBC экспрессируют поверхностные IgG, а сортировку клеток с помощью магнитных наночастиц (MACS) можно использовать для быстрого отбора антигенспецифических MBC в мягких условиях с использованием биотинилированных антигенов.

50,000 paired reads per pool and the sequence analysis was performed using our internal analysis tool. For our analysis, we only used the sequences that were observed at least twice in the sequencing run. We identified a total of 2000 unique VH sequences in the AgSC library and 2033 unique VH sequences in the TBC library pools. Although, antigen-specificity of these clones were not verified, the dominant gene families observed in the Sanger data (IGHV1-18, IGHV1-24, IGHV1-46, IGHV3-11, IGHV3-33, and IGHV4-34) were similarly represented in the NGS data (Supplementary Fig. 2). Similar to the Sanger data, we observed a high representation of IGHV3-11 gene family in the NGS data among the AgSC samples (206) in comparison to the TBC clones (121). On the contrary, the gene families IGHV4-34 and IGHV6-1, which were not represented among the AgSC clones in the Sanger data, were observed in the NGS dataset. Additionally, several new gene families (IGHV1-2, IGHV1-8, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV3-48, IGHV3-7, IGHV4-39, IGHV4-59, IGHV5-51) that were not observed in the Sanger data among both the libraries, were observed at a minor level in the NGS dataset (Supplementary Fig. 2). Since the Sanger sequencing was done with antigen specific clones while the NGS was done with the total eluate from panning rounds, it is possible that these sequences represent non-specific background phage. It is also possible that they are low frequency sequences not represented among the samples investigated for antigen specific screening and Sanger sequencing./p> 50 °C for all clones (Supplementary Fig. 4). We did not observe a significant difference in the thermal stability of Fabs from clones of either libraries against the antigen C or D (Supplementary Fig. 4a, b)./p>

About eight to ten-week-old Trianni mice (HHKK) (Trianni, San Francisco, USA) (2018)." href="/articles/s42003-022-04129-7#ref-CR42" id="ref-link-section-d65862886e2166"42 were used in all studies. All experiments were approved and conducted according to the guidelines of Sanofi Genzyme Institutional Animal Care and Use Committee. Mice were immunized with 50 µg of antigen in adjuvant (Sigma, catalog no. S6322) by intraperitoneal injection, and booster immunizations were performed for four to six times in two-week intervals. Sera were collected after third and last immunization to assess the antibody titers. The mice were rested for three weeks and boosted three days before harvesting secondary lymphoid tissues for processing B cells for antigen selection./p>95% on the day of transfection. Cell suspension (0.5 ml) was prepared to a final density of 3 × 106 cells/ml with Fresh Expi293 media into each well of 96-deep well culture plate (Fisher Scientific, catalog no. 07-000-873). Paired IgG1 heavy and kappa chain linear expression cassettes (LECs) were mixed (500 ng each) in 50 µl of Opti-MEM I medium. Separately, 5 µl ExpiFectamine 293 Reagent (Fisher Scientific, catalog no. A14524) was diluted in 50 µl of Opti-MEM (Fisher Scientific, catalog no. 31985062). The diluted ExpiFectamine 293 Reagent was then mixed with the DNA mix and incubated for 20 min at room temperature. This transfection mix was added to the Expi293F cell suspension in each well of the culture plate and mixed gently. The culture plate was sealed with porous Aeraseal film (Sigma Aldrich, catalog no. A9224-50EA) and incubated at 37 °C, 8% CO2, 900 rpm in a humidified (≥80%) incubator. After 18 h, a cocktail of Enhancer I and II (comes with the ExpiFectamine 293 Reagent kit; 5 µl of Enhancer 1 and 50 µl of Enhancer 2) was added to each well. The cells were incubated for another 120 h in 37 °C, 8% CO2, 900 rpm in a humidified (≥80%) incubator. Cell culture supernatant was harvested by centrifuging the culture plates at 1000 g for 30 min and the supernatants were transferred to Matrix 96-well storage tubes (Fisher Scientific, catalog no. 50-823-846). Antibody concentration in the culture supernatant was measured by Octet (ForteBio) and specific binding to the target antigen was tested by ELISA./p>

Binding with the target antigen was also tested through a cell-based assay, wherein, phage supernatants (50 µl) from individual colonies as used for ELISA, were incubated with wild type CHO cells and CHO cells expressing antigen D on the cell surface (30,000 cells/well) for 1 hr at RT. Cells were then washed three times with PBS-BSA-1% and further incubated with 50 µl/well of pre-conjugated mouse anti-M13 antibody (1:500 dilution) and Alexa-647 labelled anti-mouse antibody (1:200 dilution) (Invitrogen, catalog no. A28181) in dark at RT for 1 hr. Cells were then washed thrice with PBS-BSA-1%, suspended in 100 µl of PBS-BSA-1% and acquired in an iQue flow cytometry system (Sartorius) to evaluate binding of individual samples. The data was analyzed using Forcyte software (2020)." href="/articles/s42003-022-04129-7#ref-CR43" id="ref-link-section-d65862886e3135"43. Irrelevant Fab expressing negative control phage particles were also used as controls./p> (August 17, 2020)./p> (2018)./p> (2020)./p>